文獻(xiàn)速遞 | IF=15.1玉研肺部霧化給藥裝置助力彈性蛋白酶納米復(fù)合物消滅肺癌細(xì)胞

肺癌是當(dāng)異常細(xì)胞在肺部以不受控制的方式生長時(shí)開始的一種癌癥。它是一個(gè)嚴(yán)重的健康問題，可以導(dǎo)致嚴(yán)重的傷害和死亡,是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因，在男性和女性中的死亡率均為最高。目前，靶向治療是一種以干擾癌變或腫瘤增生所需的特定分子來阻止癌細(xì)胞增長的一種藥物療法，對于腫瘤中發(fā)現(xiàn)特定基因突變或生物標(biāo)志物的患者來說，是一種重要的選擇。

最近，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院林志強(qiáng)團(tuán)隊(duì)在國際知名期刊Chemical Engineering Journal（IF=15.1）發(fā)表一篇題為“An elastase nanocomplex with metal cofactors for enhancement of target protein cleavage activity and synergistic antitumor effect”的文章。該研究借鑒金屬離子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能和活性的方式，采用基于金屬輔因子的方法，以胰腺彈性蛋白酶(PPE，ELANE 同系物)為模型藥物，增強(qiáng)靶蛋白裂解和抗腫瘤效應(yīng)。作者體外開發(fā)并優(yōu)化了一種具有增強(qiáng)裂解活性的彈性蛋白酶納米復(fù)合物(CAEN)，借助玉研肺部霧化給藥裝置定量靶向給予到小鼠肺部，CAEN阻止了PPE在生物環(huán)境中的降解，并有效地將其傳遞給腫瘤細(xì)胞。通過有效裂解跨膜蛋白CD95(與游離PPE相比具有更高的特異性)，CAEN在肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)了顯著的凋亡。

 CAEN能夠保護(hù)和穩(wěn)定PPE蛋白的活性

CAEN主要通過無創(chuàng)霧化吸入進(jìn)入肺組織，實(shí)現(xiàn)肺組織特異性蛋白藥物傳遞(圖1)。在腫瘤細(xì)胞中，從CAEN釋放的PPE與Mn²⁺嵌合體特異性裂解腫瘤細(xì)胞的跨膜蛋白CD95，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而且釋放的Mn²⁺能有效增強(qiáng)肺部腫瘤組織的局部免疫反應(yīng)。

圖 1 彈性蛋白酶納米復(fù)合物(CAEN)

由于血液中存在多種絲氨酸蛋白酶，因此在實(shí)際應(yīng)用中可能會抑制PPE的活性。作者為了驗(yàn)證CAEN對血清的敏感性，在不同細(xì)胞系中使用了含或不含胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示。CAEN組在使用含或不含血清培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，均表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性作用。

圖 2 不同制劑（含或不含血清）處理后的細(xì)胞存活率

上述實(shí)驗(yàn)表明設(shè)計(jì)的CAEN能夠穩(wěn)定PPE的活性，防止其受到血清中蛋白酶抑制劑的抑制，達(dá)到完全的抗腫瘤效果。這充分說明金屬離子的礦化改性策略有望提供一種保護(hù)PPE活性的方法，CAEN的生物礦化作用為這類功能蛋白在抗腫瘤治療中的有效活性提供了納米屏障。

CAEN可特異性裂解CD95促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡

為了驗(yàn)證不同制劑組裂解CD95的能力，作者純化了MBP-CD95蛋白并進(jìn)行切割實(shí)驗(yàn)。首先，將不同制備組與MBP-CD95蛋白孵育30min，結(jié)果見圖3兩組之間的差異在于PPE組完全裂解WBP-CD95，而CAEN組僅選擇性裂解CD95蛋白。因此，彈性蛋白酶與錳離子的生物礦化復(fù)合物可以實(shí)現(xiàn)CD95 蛋白的特異性裂解。

圖 3 不同制劑與MBP-CD95體外切割效果驗(yàn)證

作者在B16-F10腫瘤細(xì)胞上進(jìn)行了細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，CAEN治療組發(fā)生凋亡的腫瘤細(xì)胞比例最顯著，表明CAEN具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

圖 4 不同制劑凋亡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析

上述實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了CAEN裂解靶蛋白的潛力及其抗腫瘤作用。

CAEN可提高藥物的輸送效率和肺部滯留時(shí)間

研究表明，與靜脈給藥相比，吸入和遞送治療藥劑可對局部惡性腫瘤組織實(shí)現(xiàn)更好的治療效果，并降低不相關(guān)的全身效應(yīng)的可能性。在文章中，作者使用玉研儀器公司的肺部霧化給藥裝置（YAN-30012）對小鼠肺部定量輸送CAEN制劑。

為了驗(yàn)證霧化裝置能夠成功給藥，作者使用考馬斯亮藍(lán)溶液(CBB)作為指示劑來證明藥物可以有效地進(jìn)入小鼠的肺組織。圖6可以觀察到小鼠肺組織中有明顯量的CBB液，主要均勻分布在氣管、支氣管。因此，肺部霧化給藥有望有效實(shí)現(xiàn)納米粒子的局部遞送和組織器官的特異性治療。

圖 5 考馬斯亮藍(lán)溶液已被霧化吸入

為了檢驗(yàn)CAEN在肺部的滯留，作者使用Cy7熒光染料標(biāo)記的PPE和CAEN進(jìn)行肺部霧化給藥，并取出肺組織用于熒光成像觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用肺部霧化給藥方法可使CAEN均勻進(jìn)入肺組織。

圖 6 小鼠霧化吸入PPE和CAEN后不同時(shí)間點(diǎn)的熒光成像結(jié)果

此外，作者還評估了肺部霧化給藥后不同制劑在肺組織中的跨粘膜吸收行為。吸入PPE-Cy7和CAEN-Cy7后24小時(shí)，處死小鼠，采集肺進(jìn)行熒光成像。熒光成像如圖所示，在用CAEN-Cy7處理的肺中觀察到更強(qiáng)和更深的熒光分布，表明礦化納米顆粒作為載體表現(xiàn)出優(yōu)異的滲透和保留能力，能夠顯著改善生物大分子蛋白的跨粘膜通透性和截留率。

圖 7 各組離體器官和肺組織切片熒光成像結(jié)果

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與游離蛋白相比，CAEN能提高細(xì)胞攝取效率，并延長蛋白在局部組織中的保留時(shí)問。

體內(nèi)遞送CAEN可抑制腫瘤生長

為驗(yàn)證CAEN的抗腫瘤作用，C57BL/6小鼠經(jīng)尾靜脈注射B16-F10細(xì)胞，形成肺癌模型。在第5、9、13、17天使用玉研肺部霧化給藥裝置給小鼠肺部給藥，進(jìn)行局部抗腫瘤治療。在第5、13和21天，解剖小鼠并收集其肺組織。隨后，作者計(jì)數(shù)了小鼠肺組織中的轉(zhuǎn)移灶（圖10）。CAEN組在抗腫瘤治療期間保持了優(yōu)異的治療效果，無明顯轉(zhuǎn)移。PPE組出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)移灶，這可能是由于PPE氣霧劑吸入無法有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，使肺組織表面的彈性纖維降解，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

腫瘤組織H&E染色顯示（圖11），CAEN給藥組小鼠組織切片中癌細(xì)胞較少，而PBS組和PPE組中癌細(xì)胞較多。

圖 8 小鼠肺部給藥示意圖

圖 9 使用PBS、PPE和CAEN治療的小鼠肺組織圖像和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量

圖 10 肺組織轉(zhuǎn)移灶的H&E染色組織學(xué)檢查

健康小鼠經(jīng)同樣處理后（圖12），發(fā)現(xiàn) PPE處理組對健康小鼠肺組織造成炎性損傷，CAEN處理組和PBS處理組無明顯變化。PPE蛋白對肺組織的損傷有利于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，這也解釋了PPE治療組小鼠在第21天出現(xiàn)嚴(yán)重腫瘤病變的原因。

圖 11 未接種腫瘤的小鼠經(jīng)同樣處理后肺組織的H&E染色結(jié)果

TUNEL染色（圖13）證實(shí)CAEN有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中CAEN組CD8+T細(xì)胞比例最高，提示其在肺腫瘤組織中有高度浸潤，有利于殺傷腫瘤細(xì)胞。

圖 12 各組小鼠肺組織TUNEL和CD8+T細(xì)胞染色結(jié)果

CAEN可以通過肺部霧化給藥實(shí)現(xiàn)器官特異性遞送，擴(kuò)大了PPE蛋白的應(yīng)用范圍。在動物實(shí)驗(yàn)中，CAEN在錳離子的輔助下，可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，激活腫瘤組織的局部免疫反應(yīng)。

結(jié)論

豬胰腺彈性蛋白酶(PPE)作為一種新型的抗腫瘤蛋白藥物，具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。然而，由于其固有的缺陷，PPE在腫瘤治療中的應(yīng)用受到限制，在本研究中，作者設(shè)計(jì)并制備了一種切割活性增強(qiáng)的彈性蛋白酶納米復(fù)合體(CAEN)，該復(fù)合體含有Ca²⁺、PPE及其輔因子(Mn²⁺)以實(shí)現(xiàn)CD95 蛋白的特異性切割。CAEN不僅有效地保護(hù)和穩(wěn)定了PPE蛋白的活性，而且在不同類型的癌細(xì)胞中也表現(xiàn)出有效的殺傷作用。通過玉研肺部霧化給藥裝置，有效實(shí)現(xiàn)了納米粒子CAEN在小鼠肺部的定量精準(zhǔn)靶向遞送和肺部組織器官的特異性治療效果。CAEN中金屬離子的釋放影響了肺部腫瘤細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高和線粒體損傷。結(jié)合Mn²⁺的免疫激活功能，CAEN在體內(nèi)外均能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長，具有良好的生物安全性?？傊?，該研究為蛋白質(zhì)藥物在抗腫瘤治療中的應(yīng)用提供了有效的研究思路。

產(chǎn)品簡介

玉研儀器肺部霧化給藥裝置(Microsprayer Aerosolizer)也稱作氣管內(nèi)霧化給藥裝置，是專門為小鼠、大鼠、豚鼠等小動物設(shè)計(jì)，可精確進(jìn)行氣管內(nèi)霧化給藥的裝置。可將定量液體通過集成在不銹鋼毛細(xì)插管中的氣溶膠霧化微噴頭霧化，毛細(xì)插管可深入動物至支氣管分叉處，實(shí)現(xiàn)氣管內(nèi)定量霧化成氣溶膠給藥。相較于傳統(tǒng)口服或注射給藥，藥物可直接作用于肺部，適用于肺部生理、病理、藥理學(xué)研究，按給藥的狀態(tài)不同還可分為液體給藥以及干粉給藥。

產(chǎn)品特點(diǎn)

l 適用于小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等小動物，也可走制大動物專用款;

l 氣管內(nèi)直接給藥，無首關(guān)消除，藥物全身效應(yīng)小

l 藥物可為液體或干粉，滿足不同需求

l 微量精確給藥，最小藥物用量25uL(液體)

l 可用于溶液、小細(xì)胞懸浮液、均質(zhì)懸濁液、粘度較低的乳濁液、干粉等給藥

l 90%藥物霧化直徑<30um(液體)，可均分布于大小肺部組織中

l 使用方便，安全穩(wěn)定，采用不銹鋼材質(zhì)，堅(jiān)固穩(wěn)走耐腐蝕

l 可用于吸入毒理學(xué)、空氣生物學(xué)、生物危害測試、吸入免疫、吸入治療、藥物研究、環(huán)境評價(jià)、危害評估和醫(yī)學(xué)防護(hù)等諸多領(lǐng)域

玉研儀器肺部霧化給藥裝置可提供中化所專業(yè)粒徑分布測試報(bào)告，從報(bào)告中可以看到90%藥物霧化直徑<30um(液體)。

霧化效果展示（GIF）

肺部霧化給藥的優(yōu)勢

1. 可直接將藥物定量遞送至肺部或以肺部為媒介。實(shí)現(xiàn)局部或系統(tǒng)疾病的治療

2. 肺部給藥可以避免肝首過效應(yīng)，降低給藥劑量，減少不良反應(yīng)

3. 肺部給藥可以快速吸收藥物進(jìn)入體循環(huán)，保持藥物的生物活性，適用于蛋白質(zhì)多肽的給藥

4. 肺部給藥是一種新型的、更有效的促進(jìn)藥物肺內(nèi)均勻分布的給藥方法，只需單次霧化，且劑量能準(zhǔn)確控制

玉研肺部給藥裝置通堵裝置

通堵裝置是一種玉研儀器最新設(shè)計(jì)，用于清除肺部給藥裝置針頭管道內(nèi)的堵塞物，和保證肺部給藥裝置內(nèi)管道暢通的工具。

l 主要功能：通堵器的設(shè)計(jì)目的是清除肺部給藥裝置針頭管道內(nèi)的堵塞物，如藥液殘留、黏附的微?；蚱渌s質(zhì)。確保藥物能夠順利到達(dá)肺部，達(dá)到預(yù)期的治療效果。

l 預(yù)防堵塞：除了清除已有的堵塞，通堵器還可以用于日常維護(hù)，定期使用可以防止藥液殘留在管道內(nèi)凝固，預(yù)防未來的堵塞問題。

l 易于使用：通堵器設(shè)計(jì)為手持工具，操作簡便，用戶可以方便地使用它進(jìn)行日常的設(shè)備維護(hù)，不需要復(fù)雜的操作。

l 清潔方便：采用高性能PEK（聚醚酮）材質(zhì)，可以使用常見的高溫高壓蒸汽滅菌或者酒精消毒，使其易于清潔和消毒，確保在使用過程中不會引入新的污染物。

拓展閱讀

1.Li, Cheng et al. “Broad neutralization of SARS-CoV-2 variants by an inhalable bispecific single-domain antibody.” Cell vol. 185,8 (2022): 1389-1401.e18. doi:10.1016/j.cell.2022.03.009

2.Peng, Boya et al. “Robust delivery of RIG-I agonists using extracellular vesicles for anti-cancer immunotherapy.” Journal of extracellular vesicles vol. 11,4 (2022): e12187. doi:10.1002/jev2.12187

3.Yue, Dayong et al. “Diesel exhaust PM2.5 greatly deteriorates fibrosis process in pre-existing pulmonary fibrosis via ferroptosis.” Environment international vol. 171 (2023): 107706. doi:10.1016/j.envint.2022.107706

4.Zhang, Mengjun et al. “Airway epithelial cell-specific delivery of lipid nanoparticles loading siRNA for asthma treatment.” Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society vol. 352 (2022): 422-437. doi:10.1016/j.jconrel.2022.10.020

5.Gu, Peiyu et al. “Protective function of interleukin-22 in pulmonary fibrosis.” Clinical and translational medicine vol. 11,8 (2021): e509. doi:10.1002/ctm2.509

6.Wu, Lan et al. “Poly(lactide-co-glycolide) Nanoparticles Mediate Sustained Gene Silencing and Improved Biocompatibility of siRNA Delivery Systems in Mouse Lungs after Pulmonary Administration.” ACS applied materials & interfaces vol. 13,3 (2021): 3722-3737. doi:10.1021/acsami.0c21259

7.Tian, Xidong et al. “Pulmonary Delivery of Reactive Oxygen Species/Glutathione-Responsive Paclitaxel Dimeric Nanoparticles Improved Therapeutic Indices against Metastatic Lung Cancer.” ACS applied materials & interfaces vol. 13,48 (2021): 56858-56872. doi:10.1021/acsami.1c16351

8.Yang, Huilin et al. “Triptolide dose-dependently improves LPS-induced alveolar hypercoagulation and fibrinolysis inhibition through NF-κB inactivation in ARDS mice.” Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie vol. 139 (2021): 111569. doi:10.1016/j.biopha.2021.111569

9.Su, Ruonan et al. “Venetoclax nanomedicine alleviates acute lung injury via increasing neutrophil apoptosis.” Biomaterials science vol. 9,13 (2021): 4746-4754. doi:10.1039/d1bm00481f

10.Xu, Yingying et al. “PEGylated pH-responsive peptide-mRNA nano self-assemblies enhance the pulmonary delivery efficiency and safety of aerosolized mRNA.” Drug delivery vol. 30,1 (2023): 2219870. doi:10.1080/10717544.2023.2219870